La colonne de chromatographie de polymérisation occupe une position importante dans l'analyse des aliments, la surveillance de l'environnement, la recherche et le développement de médicaments et d'autres domaines d'application de la chromatographie liquide (HPLC) en raison des avantages de la large gamme de résistance aux acides et aux bases, de la forte stabilité chimique, de la résistance mécanique élevée et de la complexité de la matrice applicable. Cependant, à mesure que le nombre d'utilisations augmente, les contaminants de l'échantillon (p. ex., protéines, lipides, matières organiques fortement retenues, etc.) s'adsorbent progressivement sur la surface de remplissage de la colonne chromatographique ou obstruent les pores, ce qui entraîne des problèmes tels que la diminution de l'efficacité de la colonne, La diminution de la séparation, la dérive du temps de rétention, etc. Par rapport au remplacement direct d'une nouvelle colonne de chromatographie, le traitement de régénération scientifique peut restaurer efficacement les performances de la colonne, prolonger sa durée de vie et réduire les coûts d'analyse. Ce système passe au peigne fin le type de contamination de la colonne de chromatographie de polymérisation, détaille la méthode de régénération ciblée et les points de fonctionnement, fournit des conseils techniques pour les opérations de normalisation en laboratoire.
I. principes fondamentaux de la régénération de la colonne de chromatographie de polymérisation et préparation préalable
Le cœur du traitement de régénération est l'élution des contaminants par le choix d'un système solvant approprié, sans détruire la structure de la charge polymérisée (par exemple éviter la rupture des liaisons de réticulation, la déformation des pores), tout en protégeant l'intégrité du lit de colonne. Avant de procéder à la régénération, il est nécessaire de mener à bien trois travaux préparatoires clés: premièrement, identifier le type de contamination, en combinaison avec la matrice de l'échantillon pour spéculer sur la nature des contaminants, par exemple, les échantillons biologiques contiennent souvent des contaminants protéiques, et les échantillons environnementaux peuvent contenir des résidus de matières organiques polaires fortes; Ii) recueillir les informations de base de la colonne chromatographique, consulter les instructions pour confirmer le matériau de remplissage (par exemple, polystyrène - divinylbenzène, polyméthacrylate, etc.), la gamme de solvants et la pression de résistance (généralement, la pression de résistance de la colonne de polymérisation est inférieure à celle de la colonne de gel de silice, généralement pas plus de 20 MPa); Troisièmement, effectuer un test de base de performance de la colonne pour établir une référence de comparaison de performance avant et après régénération en déterminant le nombre théorique de plateaux, le degré de séparation et le facteur de symétrie d'un échantillon standard, tel qu'une échelle de mélange de systèmes benzéniques.
II. Méthodes de régénération ciblées fondées sur le type de pollution
La pollution de la colonne de chromatographie de polymérisation peut être divisée en pollution par adsorption réversible et pollution par dépôt irréversible, la stratégie d'élution doit être choisie en fonction du mécanisme d'interaction entre le polluant et la charge, les méthodes de régénération courantes comprennent l'élution en gradient, l'élution par solvant spécifique et la régénération composite.
(i) Régénération par élution gradient de la pollution par adsorption réversible conventionnelle
Pour les contaminants d'intensité de rétention faible à modérée dans l'échantillon (par exemple, la plupart des matières organiques à petites molécules, des impuretés polaires partielles), la méthode d'élution Gradient peut être utilisée pour améliorer progressivement la force d'élution du solvant et réaliser la désorption des contaminants. Cette méthode est adaptée à l'entretien de routine des contaminations légères quotidiennes, avec les étapes opératoires spécifiques suivantes: les 10 volumes de colonne (CV) de la colonne de chromatographie sont d'abord rincés avec une phase mobile initiale telle qu'un système méthanol - eau à faible débit de 0,5 ml / min, l'échantillon résiduel à l'intérieur de la colonne étant éliminé; La proportion de solvant d'élution fort est ensuite augmentée par un gradient proportionnel, par example par passage progressif du méthanol - eau (50: 50, V / v) au méthanol pur (100%), en maintenant un débit de 0,8 ml / min pour un rinçage de 15 à 20 cv; si le mode chromatographique en phase inverse est utilisé et que le polluant contient des Constituents polaires, l'effet d'élution sur les polluants apolaires peut être renforcé par un rinçage supplémentaire de 10 CV avec du méthanol - acétonitrile (50: 50, V / v); Enfin, équilibrez 10 - 15cv avec la phase mobile initiale jusqu'à ce que la ligne de base se stabilise. Cette méthode a peu de dommages à la charge de polymérisation et le taux de récupération de l'effet de colonne après régénération peut généralement atteindre plus de 85%.
Ii) Régénération spécifique des solvants pour une forte pollution par les matières organiques retenues
Lorsque l'échantillon contient des hydrocarbures aromatiques polycycliques, des acides gras à longue chaîne et d'autres matières organiques fortement retenues, l'élution à gradient conventionnelle est difficile à éliminer et nécessite l'utilisation d'un système de solvant spécifique pour perturber les interactions hydrophobes entre les contaminants et les charges. Pour les colonnes de polymérisation de type polystyrène - divinylbenzène (PS - DVB), l'élution en trois étapes "méthanol - tétrahydrofuranne - méthanol" est recommandée: les résidus de surface sont éliminés par un rinçage de 10 CV avec du méthanol pur, suivi d'un rinçage de 20 à 30 CV avec du tétrahydrofuranne (THF) comme éluant fort, à faible vitesse de 0,3 ml / min, en utilisant le fort pouvoir solubilisant du THF pour éliminer les contaminants hydrophobes adsorbés; En raison de l'effet légèrement gonflant du THF sur la charge polymérisée, il est nécessaire de rincer ensuite 15 CV à l'envers avec du méthanol pur, de rétrécir progressivement les pores de la charge et d'éluer le THF résiduel; Enfin équilibrée avec la phase mobile initiale. Si le contaminant est une substance polaire forte (par exemple, un composé aminé), 0,1% (TFA) peut être ajouté dans le système d'élution, en ajustant le pH pour atténuer l'interaction polaire, mais il faut noter que la concentration de TFA ne doit pas dépasser 0,5%, et après régénération, il faut neutraliser Le rinçage 5cv avec une solution méthanolique contenant 0,05% d'ammoniaque pour éviter la corrosion résiduelle acide du lit de colonne.
Iii) Régénération par recombinaison enzymolyse - solvant des contaminations macromoléculaires biologiques
Après l'analyse d'échantillons biologiques tels que le sérum, l'urine, les extraits de plantes, les protéines, les acides nucléiques, les Polysaccharides et autres macromolécules biologiques sont susceptibles d'être fortement adsorbées sur la surface de la charge polymérisée par action hydrophobe ou par liaison hydrogène, ou même de former des dépôts gélifiés bloquant les pores, L'effet de l'élution par solvant seul est limité. La stratégie de régénération complexe "prétraitement enzymolytique + élution par solvant" est à mettre en oeuvre à ce stade: on commence par formuler une solution tampon (tampon phosphate pH 7,0) contenant une protéase telle que la trypsine à une concentration de 0,1 mg / ML, on rince la colonne de chromatographie 30cv à un débit de 0,2 ml / min, on laisse l'enzyme dégrader suffisamment les contaminants protéiques lorsqu'on la laisse reposer à 37°c pendant 2 heures; Le liquide enzymatique résiduel est ensuite éliminé par un rinçage de 10 CV avec une solution aqueuse de méthanol à 5%, puis élué selon un gradient séquentiel "eau - méthanol - acétonitrile - méthanol", avec un rinçage de 15 CV par palier de solvant et un débit contrôlé à 0,5 ml / min; Le 5cv (inhibition de la reproduction microbienne) est enfin rincé avec une solution méthanolique à 0,01% d'azinate de sodium et séquestré dans du méthanol pur. Régénération de la colonne de contamination biologique par cette méthode, peut ramener le nombre de plateaux théoriques à plus de 80% de la nouvelle colonne.
Iv) Régénération par rinçage de la pollution par les sels et les particules
Lorsque la phase mobile contient des sels tampons (p. ex., phosphate, acétate d'ammonium) ou que l'échantillon contient des particules en suspension, il se forme facilement des cristaux de salinisation ou des dépôts de particules à l'entrée de la colonne, ce qui entraîne une augmentation anormale de la pression de la colonne. La régénération de ce type de contamination est axée sur la « dissolution à faible intensité + rinçage physique »: la colonne chromatographique est d'abord reliée en sens inverse (en évitant de pousser les contaminants profondément dans le lit de la colonne), les sels dissous cristallisent par rinçage à faible vitesse de 20 CV avec de l'eau Ultrapure à 0,3 ml / min; Si la pression de la colonne reste élevée, une solution aqueuse de méthanol à 5% peut être utilisée pour rincer 15 CV, en utilisant la faible capacité d'élution du méthanol pour aider à éliminer les particules; Pour les particules réfractaires, un rinçage alterné "eau - méthanol - eau" peut être utilisé pendant 3 cycles pour décaper le dépôt par la force de cisaillement résultant de la variation de viscosité du solvant. A noter que la pression ne doit pas dépasser la colonne chromatographique pendant le rinçageRésistant à 80% de la pression, et après régénération doit être connecté vers l'avant, avec la phase mobile initiale équilibrée à la ligne de base stable.
Iii. Considérations clés et évaluation des effets des opérations de régénération
La spécification de fonctionnement dans le processus de régénération affecte directement l'effet de récupération des performances de la colonne et la durée de vie, il est nécessaire de suivre strictement quatre principes: l'un est le contrôle du débit et de la pression, tout au long de l'utilisation d'un faible débit (0,3 - 0,8 ml / min) pour démarrer, éviter l'effondrement du lit de colonne résultant d'une augmentation soudaine de la pression, le pic de pression ne dépasse pas la limite supérieure spécifiée dans les instructions; Deuxièmement, éviter la mutation du solvant, différents solvants doivent utiliser une transition de gradient lors de la commutation (par exemple, lorsque le méthanol passe au THF, ajuster progressivement la proportion en fonction du gradient de 10%), empêcher la mutation polaire du solvant de provoquer un gonflement inégal de la charge; III est interdit les solvants contre - indiqués, tels que le chloroforme, le dichlorométhane et d'autres solvants hydrocarbonés halogénés pour les colonnes de polymérisation de type polyméthacrylate, la colonne PS - DVB évite le contact à long terme avec des solvants fortement basiques (pH > 12); Quatre est la protection de stockage après régénération, le stockage à court terme inutile avec du méthanol pur ou de l'acétonitrile, le stockage à long terme nécessite un remplacement régulier du solvant de stockage (tous les 3 mois).
L'évaluation de l'efficacité de la régénération doit être validée par trois indicateurs principaux: le nombre de plateaux théoriques (une augmentation de plus de 50% par rapport à la période précédant la régénération est effective), la séparation (la séparation des pics adjacents est rétablie à plus de 1,5) et l'écart type relatif du temps de rétention (DSR < 2%). Si, après plusieurs régénérations, le degré de séparation de l'échantillon standard reste inférieur à 1,0 ou si la pression de la colonne continue d'augmenter de plus de 50% par rapport à la nouvelle colonne, cela indique que la colonne chromatographique n'a pas pu être régénérée efficacement et qu'une nouvelle colonne doit être remplacée.
Iv. Conclusion
L'effet Régénérateur de la colonne de chromatographie de polymérisation dépend de la précision du jugement du type de contamination par rapport à l'adéquation de la méthode de régénération. En usage quotidien, un mode de gestion « priorité à la prévention, régénération graduée » doit être mis en place: réduction de l’apport de contaminants par prétraitement des échantillons (p. ex. filtration, extraction), entretien régulier avec un léger gradient d’élution; Sélection précise des stratégies de régénération telles que l'enzymolyse, les solvants spécifiques, etc. pour différents types de contamination et contrôle strict des paramètres opérationnels. Le traitement régénératif scientifique peut non seulement réduire considérablement le coût des consommables de laboratoire, mais également garantir la précision et la fiabilité des données d'analyse en maintenant la stabilité des performances de la colonne et en fournissant un support solide pour la réalisation efficace des travaux d'analyse par chromatographie liquide.