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PerkinElmer Enterprise Management (Shanghai) Co., Ltd
Analyse d'imagerie ATR des matériaux horizon ｜ comprimés pharmaceutiques
Date :2025-11-08Lire :4
Ces dernières années, leTechnologie d'imagerie chimique de comprimés pharmaceutiquesReçoit une attention de plus en plus large. Avec l'amélioration technologique et la popularité des applications, l'imagerie chimique est devenue un moyen efficace d'obtenir des informations sur les paramètres de qualité clés, qui sont souvent difficiles à déterminer avec précision par d'autres techniques. À l'exception des grandes entreprises pharmaceutiques, les fabricants de médicaments génériques et même les organismes de réglementation 1 reconnaissent désormais la valeur de la technologie dans la détection des défauts de production, l'augmentation de l'échelle de production et l'analyse des causes sous - jacentes.
Parmi les nombreuses techniques d'imagerie,Technologie d'imagerie proche infrarouge (NIR)Obtenez le plus d'attention grâce à ses avantages significatifs et Démontrez un potentiel de développement continu en tant que moyen de technologie d'analyse de processus (PAT) 3. D'autres techniques d'imagerie chimique, telles que l'imagerie Raman et la réflexion diffuse dans l'infrarouge moyen, sont supérieures, maisNIRMise en œuvre technique, facilité d'utilisation et adaptabilité des échantillonsPlus d'avantages- Oui.
Les données générées par cette technique sont également plus faciles à comprendre pour de nombreux utilisateurs dans ce domaine, car ils peuvent avoir de l'expérience dans l'analyse spectroscopique macro - proche infrarouge de la composition des comprimés. Cependant, l'imagerie NIR dans les conditions de l'art antérieur (qu'il s'agisse d'une transformée de Fourier, d'un filtre réglable ou d'un filtre fixe) présente des limites essentielles qui trouvent leur origine dans le principe de mesure lui - même plutôt que dans des défauts techniques.
tout d'abord
La profondeur de pénétration de la lumière incidente dans l'échantillon est importante (de l'ordre de quelques dizaines de microns) et les propriétés de réflexion diffuse provoquent un flou important de l'image. Selon les estimations, la profondeur de pénétration de l'échantillon atteint au moins 10 microns (en fonction de paramètres tels que la taille des particules, la charge, etc.), mais de nombreux composants de comprimés ont une taille de particules inférieure à 10 microns lorsqu'ils sont mis dans un mélangeur pour le mélange. Ainsi, à moins que ces Constituents ne forment des agrégats, cette technique peine à obtenir des images montrant clairement la distribution spatiale des caractéristiques des constituents.
Il est à noter que les distributions de tailles de particules individuelles inférieures à 10 microns ne sont pas encore abordées dans la littérature existante sur l'imagerie NIR. Les cas de recherche se concentrent principalement sur de petits agrégats de particules ou de plus grandes particules de dizaines à des centaines de microns, tandis que les particules de taille inférieure à 10 microns devraient être présentes dans la distribution. Pour certains composants (par exemple, le stéarate de magnésium), même à des concentrations plus élevées, si des agrégats d'environ 30 à 40 microns ou plus ne sont pas formés, ils peuvent être difficiles à détecter par imagerie NIR car la substance est distribuée dans toute la matrice en particules relativement fines. En effet, certains principes actifs à des teneurs inférieures à 1% ne peuvent tout simplement pas être détectés à moins de former des agrégats.
Deuxièmement
Les spectres NIR mesurés en imagerie ont tendance à présenter un chevauchement élevé. Dans l'analyse spectroscopique macroscopique proche infrarouge, les spectres NIR ne sont généralement pas aussi discriminants que l'imagerie Raman correspondante ou la spectroscopie infrarouge moyen, et cet inconvénient est plus prononcé dans l'imagerie NIR avec un rapport signal sur bruit inférieur à celui de l'analyse spectroscopique macroscopique proche infrarouge. Ces deux facteurs majeurs font que l'analyse d'imagerie est fortement dépendante de l'analyse chimiométrique des données spectrales. En outre, l'analyse d'image ultérieure nécessite l'application de techniques statistiques de pixels, qui nécessitent généralement de classer les pixels d'image individuels par catégorie chimique, mais sont extrêmement difficiles à réaliser dans la pratique, car les spectres de composants présentés par les pixels individuels dans les images NIR sont rarement purs. Cela rend l'analyse globale de l'image NIR plus difficile, car les pixels en niveaux de gris ont tendance à avoir un certain degré de subjectivité lorsqu'ils sont affectés à un "1" ou à un "0".
Par rapport à d'autres techniques, la technique d'imagerie spectrale ATR (réflexion totale atténuée) en spectroscopie infrarouge moyen présente des avantages significatifs dans ce domaine d'application: sa résolution spatiale est supérieure d'environ un ordre de grandeur à celle de l'imagerie NIR et atteint aujourd'hui une taille de particule unique lorsque de nombreux composants entrent en traitement, c'est - à - dire inférieure à 10 microns.Technologie d'imagerie ATR confirmée avec une résolution spatiale supérieure à 5 microns4; deuxièmement, le spectre dans l'image a un contraste plus élevé et il est plus facile de distinguer les différents composants par rapport à NIR; Troisièmement, cette technique est en fait une technique d'analyse de surface, la profondeur de pénétration de l'échantillon n'étant que de l'ordre de 1 à 2 microns avec la configuration optique décrite ci - après. Cela rend le spectre d'un seul pixel relativement plus pur, ce qui réduit considérablement la charge de travail de l'analyse d'image ultérieure, avec des avantages évidents par rapport à la technologie NIR.Certaines techniques d'analyse d'imagerie NIR hyperspectrale sont entièrement applicables à l'analyse d'imagerie ATR- Oui.
La technologie ATR offre également les avantages suivants:
•Une grande bibliothèque spectrale commerciale peut être appelée directement pour la discrimination qualitative;
•Pour les substances difficiles à identifier par la technologie NIR (comme certains sels inorganiques anhydres), la technologie ATR produit des spectres à contraste élevé.
Nous avons étéPerkin Elmer Spotlight ™ 400 microimaging Systems développe des accessoires ATR，Et compléter les tests de comprimés de médicaments multiplesCe document d'application mesure par imagerie ATR de comprimés pharmaceutiques disponibles dans le commerce et valide de nombreux avantages techniques décrits précédemment.Cette technologie marque une percée majeure dans la technologie d'imagerie de comprimés pharmaceutiquesBien qu'il en soit encore au stade « embryonnaire», il est prévu qu'il jouera un rôle important dans l'analyse des comprimés et des mélanges de médicaments à l'avenir.
Conception expérimentale
01 Préparation des échantillons et présentation
Cet article utilise des comprimés pharmaceutiques complets non enrobés (avec prescription versus over - the - Counter (OTC)) et des échantillons de matières premières connues pour être présentes dans les comprimés sont prélevés. La composition du médicament d'ordonnance comprend: ingrédient actif, Cellulose microcristalline, Hydrogénophosphate de calcium, amidon et stéarate de magnésium; Les matières premières des produits OTC sont l'aspirine, l'acétaminophène, la caféine, ainsi qu'une variété d'Excipients organiques et inorganiques. Dans cet exemple, les comprimés ont une épaisseur de 2 - 3 mm, avec des côtés verticaux et une surface plane.
L'accessoire ATR utilise des cristaux de germanium (Figure 1) qui s'adaptent à la surface de la tablette. Les caractéristiques de conception de cet accessoire sont les suivantes: la zone cible de l'échantillon (roi) peut être localisée via une caméra microscopique à lumière visible, ce qui permet à la surface d'échantillonnage ATR de couvrir précisément le roi sans déplacer l'échantillon. L'extrémité collée du cristal peut former une zone d'échantillonnage circulaire dans laquelle des zones d'imagerie carrées ou rectangulaires de tailles différentes peuvent être définies. Calculé avec une taille de pixel d'image de 1,56 micron, il contiendra plus de 102 000 données spectrales indépendantes dans une zone de 500 × 500 microns.
Figure 1. Configuration d'échantillonnage ATR
Pour effectuer l'analyse d'image la plus complète, il peut être nécessaire d'obtenir le spectre ATR de la matière première du comprimé comme référence. Le meilleur Protocole consiste à mesurer les spectres directement à l'aide d'un système d'imagerie ATR plutôt qu'à partir d'une base de référence standard, bien que ce dernier protocole puisse également être utilisé, ce qui entraîne une diminution de la qualité de l'analyse des images. Cet article a préparé des microplaques simples pour chaque matière première des comprimés en utilisant un accessoire de microplaque standard de bromure de potassium (KBR) couramment utilisé dans l'analyse spectroscopique infrarouge. Avec l'accessoire standard de microplaquette (moule de 2 mm), la pression à la main permet de préparer des microplaquettes adaptées à l'acquisition de données ATR. Après pressage, les comprimés sont transférés sur un accessoire ATR pour des mesures d'imagerie sur de petites zones de 50 x 50 microns des composants purs. Sur la base de ces images, un spectre de référence séparé est calculé à l'aide d'un logiciel. L'acquisition de l'image de référence pour chaque composant ne prend que quelques minutes et de telles opérations ne sont généralement effectuées qu'une seule fois.
02 Imagerie
Avec Spotlight standard équipé d'un accessoire d'imagerie ATR ™ 400 système d'imagerie microscopique pour l'acquisition d'images- Oui.Le système génère des images grâce à la synergie du détecteur matriciel MCT avec la table d'échantillonnage mobile / l'accessoire ATR. Le Cristal ATR est fixé à la surface de l'échantillon et reste relativement immobile avec l'échantillon - l'échantillon et le cristal ATR dans leur ensemble se déplacent par rapport au détecteur. Les pixels de l'image mesurent 1,56 × 1,56 microns (optionnel 6,25 × 6,25 microns) et ont une résolution spectrale de 16 cm - 1. Les dimensions réelles des images acquises ici vont de 100 x 100 microns à 400 x 400 microns, avec un temps d'acquisition total compris entre 1 minute et environ 40 minutes.
Le traitement des données d'image comprend des étapes telles que la microdifférenciation spectrale, la normalisation, l'analyse en composantes principales et l'ajustement de la courbe spectrale complète des moindres carrés. 5 autres améliorations graphiques de l'image et des analyses statistiques ont été effectuées.
Résultats et discussions
En tant que technique de contact, l'échantillon est contaminé une fois qu'il touche la surface du cristal, de sorte que le cristal doit être nettoyé avant chaque imagerie. Cependant, le processus de nettoyage est relativement rapide, sauf si les particules de comprimés ont une forte adhérence.
En tant que technique de contact, l'échantillon est contaminé une fois qu'il touche la surface du cristal, de sorte que le cristal doit être nettoyé avant chaque imagerie. Cependant, le processus de nettoyage est relativement rapide, sauf si les particules de comprimés ont une forte adhérence.
La Figure 2A montre une image microscopique visible de la surface du comprimé. Bien que certaines structures de particules puissent être identifiées, les images en lumière visible ne permettent pas de distinguer efficacement les particules de chaque composant.
La figure 2B montre alors clairement la répartition de la composante amidon. Cette image est obtenue après les étapes de traitement multiple décrites dans cette section sur les données d'imagerie ATR.
Une approche similaire permet de déduire le modèle de distribution de chaque composant, ce qui permet de construire une image composite. Dans cet article, les images des trois principaux composants ont été fusionnées en une seule image composite rgb (rouge / vert / bleu) à trois canaux (figure 2c), et de telles méthodes de caractérisation sont plus couramment utilisées dans l'imagerie NIR de ces produits. Ce test se distingue par une résolution spatiale nettement améliorée par rapport à l'imagerie NIR, un contraste spatial plus élevé des images, ce qui permet d'obtenir des images plus nettes et plus exhaustives de la surface du comprimé en un temps de mesure relativement court et de localiser des zones microscopiques qui ne peuvent pas être détectées par les techniques d'imagerie NIR actuelles.
Figure 2.3 image en lumière visible de la surface du comprimé pour les principaux composants (A), imagerie infrarouge monocomposant après traitement différentiel (b) et image composite (c) (cliquez pour agrandir)
01 Spectres de matières premières
La figure 3 représente le spectre ATR d'une charge de comprimé et son spectre de traitement différentiel correspondent du premier ordre; etOn peut observer par imagerie ATR que le champ d'illumination sur toute la surface de l'élément cristallin n'est pas parfaitement plat, ce qui se traduit principalement par la présence d'un phénomène de décalage de base lisse du spectre mesuré dans toute la zone cristalline. Ce problème peut être facilement résolu en utilisant la différenciation du premier ou du deuxième ordre. Il est à noter que la caractérisation spectrale des matières premières de cette méthode est plus marquée que celle de l'imagerie dans le proche infrarouge, ce qui offre une plus grande possibilité d'adopter une approche univariée plus simple dans l'analyse d'images. Au cours de l'essai, une matière première commune, la Polyvinylpyrrolidone, qui n'était pas présente dans les comprimés, a été ajoutée comme échantillon d'essai pour vérifier l'efficacité du traitement ultérieur des données.
Figure 3. Composition des matières premières (cliquez pour agrandir l'image)
02 Détection de la présence de composants de comprimés
La première étape consiste à confirmer si les caractéristiques spectrales de la matière première sont présentes dans le spectre de l'image. Cette étape est réalisée grâce à la fonction « Target » du logiciel. Le spectre de l'image est d'abord prétraité (traitement différentiel de premier ordre avec suppression de la zone d'absorption du dioxyde de carbone), puis la contribution spectrale indépendante principale est extraite par analyse en composantes principales (ACP). Les spectres de matière première ou de « cible » sont ensuite ajustés avec une combinaison linéaire de composants principaux de PCA, le degré d'étanchéité de l'ajustement permettant de déterminer si un spectre cible est présent dans le spectre de l'image.La figure 4 montre les résultats de la détection des cinq composants du comprimé- Oui.Les cinq ingrédientsLa qualité de l'ajustement est excellente，Et l'ajustement de Povidone est de mauvaise qualitéForte validation de la méthodeFiabilité- Oui.
Figure 4. Détection de la présence de matières premières
03 Évaluer la distribution de chaque ingrédient dans le comprimé
Après avoir confirmé la présence d'un spectre cible dans le spectre de l'image, l'étape suivante consiste à générer une carte de distribution de chaque composant en estimant l'abondance relative des composants pour chaque point de pixel de l'image. Bien qu'il existe une variété de méthodes, pour ce système à cinq composants (en supposant qu'il n'y a pas de réaction chimique entre les composants et qu'un spectre de matière première pur est disponible), des études ont montré que la méthode simple d'ajustement de la courbe spectrale complète fonctionnait bien. Après avoir examiné l'image résiduelle, vérifié la présence d'autres composants chimiques par l'analyse en composantes principales décrite ci - dessus, il suffit de modéliser le spectre de chaque pixel comme une combinaison linéaire des spectres de la matière première. Il est à noter que la fiabilité de cette technique est diminuée s'il existe une forte corrélation croisée entre les spectres cibles (c'est - à - dire que plusieurs spectres cibles ont plusieurs pics caractéristiques communs). Dans cet example, la cellulose microcristalline présente une certaine corrélation avec le spectre de l'amidon, mais sa différence reste suffisante pour garantir de bonnes conditions d'ajustement de la courbe des moindres carrés.La figure 5 présente les résultats de l'ajustement des courbes spectrales pour les cinq composantes, l'intensité des pixels dans chaque image reflète visuellement l'abondance relative du spectre cible dans le spectre de l'image.
Figure 5a. Image ajustée des moindres carrés de cellulose microcristalline
Figure 5b. Diagramme de distribution de l'amidon
Figure 5c. Carte de distribution du phosphate de calcium
Figure 5D. Diagramme de distribution du stéarate de magnésium
Figure 5e. Carte de distribution du principe actif (< 1%)
Dans la plupart des cas, les zones "Hotspot" dans l'image dérivée présentent des caractéristiques similaires au spectre du composant pur, tandis que les pixels sur les bords des particules présentent les caractéristiques spectrales "mixtes" attendues.La figure montre le spectre de Hotspot typique et le spectre de matière première correspondant- Oui.
Ces images présentent trois caractéristiques remarquables:
1 Le contraste spectral et la netteté de l'image sont remarquables, bien au - delà des images produites par la plupart des techniques d'imagerie NIR. Cela peut être facilement vérifié en dessinant une distribution d'histogramme d'image.
2 Non seulement les zones chaudes (particules) de différents composants présentent des différences de forme, mais elles commencent également à prendre une forme similaire à celle des particules de matière première. Par exemple, la figure 6a montre une image de microscopie électronique à balayage (MEB) de particules d'amidon, les particules d'amidon visibles étant très sphériques, contrairement à de nombreux autres composants. Alors que les particules présentent des formes similaires dans l'image dérivée ATR correspondante (Figure 6B). De même, la forme irrégulière des régions de stéarate de magnésium et de cellulose microcristalline s'accorde également fortement avec l'image SEM de la matière première. Cette découverte a bénéficié d'une amélioration de la fidélité de l'imagerie par rapport au NIR, fournissant une base supplémentaire importante pour comprendre l'Association de la distribution spatiale avec les attributs de qualité du produit.
Figure 6. Forme de l'image des particules ATR - comparaison avec SEM
3 Cette technique permet de distinguer des particules individuelles de moins de 10 microns. La figure 7 montre une zone agrandie de la carte de répartition calculée du principe actif, dont la concentration connue en poids dans les comprimés est inférieure à 1%, où des points chauds de 6 - 7 microns de diamètre sont visibles. Les spectres aux points chauds montrent que de nombreux points de pixels présentent presque entièrement le spectre pur du principe actif. Il convient de noter que des études de résolution indépendantes6 estiment que la résolution spatiale de la technique peut atteindre l'ordre de 3 - 4 microns autour d'un nombre d'onde d'environ 1700 CM - 1, et que la clarté du spectre de particules individuelles est également remarquable.
Figure 7a. Carte de distribution du principe actif (< 1%)
Figure 7b. Particules de principe actif < 10 microns
Un deuxième example est illustré à la figure 8 où la résolution des petites particules est illustrée. Cet exemple présente une analyse d'imagerie d'une sorte de comprimé analgésique soluble OTC.La technologie d'imagerie NIR démontre souvent ses capacités analytiques avec de tels produits comme échantillons de démonstration. Ses principaux composants - l'aspirine, l'acétaminophène et la caféine - sont distribués morphologiquement dans de grandes régions avec des tailles de particules de plusieurs dizaines à plusieurs centaines de microns. Mais cet example ne présente pas seulement une image des principaux Constituents mentionnés ci - dessus, mais réussit également à présenter des excipients présentant les caractéristiques suivantes: (A) faible teneur; B) plus important encore, la taille de sa zone de distribution est inférieure à 10 microns. Alors que de nombreux Excipients et substances médicamenteuses (IPA) ont des tailles de particules initiales inférieures à 10 microns, la technologie d'imagerie NIR a du mal à détecter les particules individuelles à cette échelle et ne peut détecter que les agrégats de plus grande taille formés par ces particules. La figure montre non seulement le composant principal, mais également les particules individuelles de phosphate de calcium indétectables par NIR contenues dans la distribution aspirine / caféine / acétaminophène.
Figure 8a. Comprimés analgésiques – structure générale – aspirine
Figure 8B. Recouvrement des distributions d'acétaminophène
Figure 8C. Recouvrement des distributions de cellulose microcristalline
Figure 8d. Révéler les composants traces - carbonate de calcium
Figure 8e. Vue éclatée d'une image de carbonate de calcium
Figure 8f. Carbonate de calcium dans la région de l'aspirine
04 Caractérisation de la distribution des composants des comprimés
Carte de distribution à ingrédient unique de haute qualité comme illustré à la figure 9L'œil humain peut observer des différences évidentes entre les différents composants des comprimés. Mais pour une caractérisation plus rapide et plus objective, il est nécessaire d'adopter une expression différente de l'image. Une méthode estReprésentation histogramme de l'intensité d'une image.L'approche conventionnelle est que, pour une image spécifiée, la luminosité des pixels correspondante est tracée en fonction du nombre de pixels, et des informations utiles relatives aux paramètres de processus clés de la tablette peuvent être obtenues par analyse de l'histogramme généré. Pour les images ATR haute définition, lorsque la distribution des composants est ainsi cartographiée, l'histogramme résultant présente généralement deux modes différents correspondent respectivement àGroupe de particules cibleetParticules restantes(figure 9A). Cependant, la ligne de démarcation entre ces deux zones de l'histogramme n'est pas toujours clairement reconnaissable. Comme il s'agit d'une image en niveaux de gris, il y aura un grand nombre de pixels entre les pixels granulaires "purs" et les pixels d'arrière - plan "purs". Lors du comptage des pixels, ces pixels doivent être classés comme pixels de premier plan ou pixels d'arrière - plan, c'est - à - dire qu'un seuil d'intensité doit être fixé: les pixels au - dessus de ce seuil appartiennent à la particule cible et les pixels au - dessous de ce seuil appartiennent aux pixels d'arrière - plan.
Figure 9A. Histogramme de la distribution des composants individuels (cliquez pour l'agrandir)
Les seuils peuvent être déterminés par des algorithmes mathématiques (par exemple, la « méthode de l'entropie maximale» ⁵) ou sur la base d'une expérience subjective. Pour l'analyse d'images ATR, il s'est avéré utile de combiner les informations suivantes pour déterminer le seuil d'intensité: taille des particules de la matière première, ajustement du seuil itératif et résultats de l'examen du spectre de pixels sous - jacent.
La figure 9b montre le processus de réglage du seuilPour:On a représenté sur la figure une image en niveaux de gris calculés d'une distribution de composants dont le seuil d'intensité est fixé à deux niveaux pour retenir les pixels d'image les plus intenses. Quelle image est correcte? Bien que la discussion détaillée de la question ait dépassé le cadre de cet article, la fixation de ce seuil est essentielle pour obtenir des informations quantitatives précises à partir de ces images et doit être traitée avec la plus grande prudence. Cependant, lorsqu'une distribution de particules clairement identifiable est calculée, certains résultats statistiques obtenus (tels que la taille moyenne des particules, la forme de la distribution, les informations sur les voisins les plus proches, etc.) sont associés aux attributs de qualité du produit.
Figure 9b. Définissez le seuil a - B pour produire une image binaire (cliquez pour l'agrandir)
La figure 9c montre la répartition calculée des ingrédients pour un ingrédient donné dans deux lots de produits étiquetés « qualifié » par rapport à « non qualifié ».- Oui.Cinq images de différents échantillons de lots admissibles et de lots non admissibles ont été prises séparément. À l'exception d'un ingrédient, les calculs de la taille moyenne des particules pour tous les autres ingrédients du lot admissible et non admissible concordent. Alors que pour cet ingrédient spécial, toutes les images montrent que la taille moyenne des particules du lot non qualifié est environ 2 fois supérieure à celle du lot qualifié. Ce type d'information est extrêmement précieux pour identifier les problèmes de processus de production.
Figure 9c. Certains indicateurs peuvent être associés à des paramètres de qualité (cliquez pour agrandir l'image)
conclusion
Technologie d'imagerie chimique ATRÉlevé certains types de comprimés de médicaments imagerie chimiqueNiveau technique. par rapport à l'imagerie chimique NIR, cette technologie améliore considérablement la résolution spatiale de l'image, ce qui permet d'obtenirDes images plus claires et souvent plus lisibles.Cette technique surmonte les principales limites de l'imagerie directe par réflexion diffuse dans l'analyse spectrale infrarouge moyen, à savoir les problèmes d'atténuation élevée du signal et d'interférences de réflexion spéculaire incontrôlée dans l'image. en même tempsRésoluPlusieurs défauts dans l'imagerie Raman, y comprisSurchauffe de l'échantillon, perturbation potentielle de la fluorescence, résolution spatiale limitée(en fonction de la configuration matérielle de Raman Imaging) etTemps d'acquisition d'image relativement long- Oui.
Références
1. Lyon, R.; Lester, D.; Lewis, E. N.; Lee, E.; Yu, L. X.; Jefferson, E. H.; Hussain, A. S.: AAPS
PharmsciTech 2002; 3, paragraphe 3, article 17.
2. Clarke, F.; Vib Spec., 34 (2004) 25 à 35. Disponible en ligne à www.sciencedirect.com.
3. Lewis, E. N.; Schoppelrei, W.; Lee, E.; Kidder, L.; dans « Process Analytical Technology » Blackwell, 2005. ISBN-10 1-4051-2103-3.
4. Canas, A.; Carter, R.; Hoult, R.; Vendeurs, J.; Williams, S.; Conférence FACCS «Résolution spatiale dans l'imagerie ATR IR moyen: mesure et signification», 2006.
5. Rasband, W. S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda (Maryland), États-Unis, 1997-2006.
6. «Résolution spatiale en imagerie ATR FT-IR» Note technique PerkinElmer n° 007641_03 (2006).