2025an9Mois, de plusieurs institutions telles que la dermatologie à l'Université de Kyoto Graduate School of MedicineNaomi KitayamaL’équipe de recherche, enRecherche biochimique et biophysique CommunicationsPublié dans le Journal sous le titreCibler le PAR-2 dans la dermatite atopique: évaluation préclinique du nouveau inhibiteur E6795L'étude. L'étude se concentre sur la dermatite atopique (AD), mécanismes pathologiques, activation des récepteurs aux nouvelles protéases2(PAR-2) inhibiteurs de petites moléculesE6795Une évaluation préclinique a été réalisée pour étudier son améliorationADEffets liés à l'inflammation, aux démangeaisons et au dysfonctionnement de la barrière cutanée.

Résumé

Dermatite atopique (AD), est une maladie inflammatoire chronique de la peau caractérisée par des lésions cutanées eczémateuses, des démangeaisons intenses et une altération de la fonction de barrière cutanée. Malgré l'émergence de nouveaux traitements, de nombreux patients sont confrontés à un contrôle insuffisant de la maladie, à des coûts de traitement élevés et à des rechutes. Récepteurs activés par la protéase2(PAR-2) dansADLa surexpression dans les lésions cutanées joue un rôle dans la promotion de la réponse inflammatoire, la production de démangeaisons et le déséquilibre de l'homéostasie épidermique. Cette étude fournitE6795Preuve d'études précliniques que le composé est une petite molécule spécialement conçue pour cibler les processus pathologiques ci - dessusPAR-2Inhibiteurs. Les analyses kinases et pharmacologiques confirment,E6795Inhibible sélectivementPAR-2, a montré une interaction extrêmement faible hors cible dans un large panel de kinases et de tests pharmacologiques. En outre,E6795Amélioré dans les deux modèles de sourisADIndicateurs de paramètres pertinents, y compris l'atténuation de la réponse inflammatoire et l'infiltration de cellules immunitaires; L'administration orale réduit la perte d'eau transépidermique (TEWL), et2%Les préparations de crème topique améliorent les manifestations histologiques et les symptômes de démangeaisons associés à la fonction barrière. L'examen histologique confirme,E6795L'infiltration de cellules inflammatoires diminue après le traitement et la fonction de barrière cutanée est améliorée. Les résultats de l'étude montrent que,E6795Par inhibition sélectivePAR-2Conduction du signal, action ciblée surADLes trois piliers de la physiopathologie– –Dysfonctionnement de la barrière, réaction inflammatoire et démangeaisons. Cette étude souligneE6795Comme un nouveau type rentableADPotentiel de médicaments thérapeutiques topiques.

ExpérimentationsMatériaux et instruments

I) matériel expérimental

1. Animaux de laboratoire:11 - 12Sexe masculin hebdomadaireNc/NgaSouris,6 à 14Femelles d'âge hebdomadaireBALB/cSouris,6 à 10Sexe masculin hebdomadaireC57BL/6JLa souris.

2. Réactifs et anticorps:MC903Et,E6795Et,PAR-2Peptides agonistesSligkv - nh8322ndle;etSLIGRL-NH ₂, trypsine, thrombine, carboxyméthylcellulose, diméthylsulfoxyde, urantan, divers anticorps fluorescents marqués,FLIPRRéactifs de dosage du calcium, collagénaseIIType,DNase I、10%Formaline, sumérine-Réactif de teinture rouge yin, réactif de teinture bleu Toluidine, etc.

3. Échantillons de cellules et de tissus: rein embryonnaire humainHek293Cellules, échantillons de peau humaine saine,ADUn échantillon de la peau de la lésion du patient.

Ii) Instruments expérimentaux

FDSS6000Système de détection de fluorescence,FACS FortesseCytométrie de flux,FlowJoLogiciel, Épaissimètre, système de mesure des rayures,384Plaque réservoir de réactifs en polypropylène à trous,JeType collagène sac est fond transparent noir384Plaques, cages de ventilation, microscopes et systèmes d'analyse d'images,ASCHScan de vaporisationAppareil de mesure de la perte d'eau percutanée

ASCH VAPOSCANAppareil de mesure de la perte d'eau percutanée

Processus expérimental

1. Expérimentation cellulaire:Hek293Les cellules contiennent3%Du sérum de veau foetalDMEMCultivé en milieu, inoculé dans384Charge derrière la plaque de trouFLIPRRéactifs pour la détermination du calcium, ajoutés à différentes concentrationsE6795Pré - traitement30Minutes, ajouter à nouveau la trypsine ou la thrombine, passerFDSS6000Surveillance du système120Intensité de fluorescence en temps réel en secondes avec quatre paramètreslogistiqueCalcul du modèleIC₅₀Valeur.

2. Construction et administration de modèles animaux:

￮MC903InductionADModèle:BALB/cOreille de souris continue8Application topique par jourMC903, à partir de la4À partir de jours, par voie orale quotidienne contientE6795Suspension de carboxyméthylcellulose, le groupe témoin a administré le solvant correspondant.

￮Nc/NgaSérieuxADModèle: aura une dermatiteNc/NgaLes souris sont divisées en5Groupe, application topique quotidienneE6795Crème, continue7Jours, placez le groupe non traité comme contrôle biologique.

3. Évaluation pharmacodynamique:

Fonction barrière cutanée: parASCHScan de vaporisationAppareil de mesure de la perte d'eau percutanéeMesurer le numéro0、3、7Perte d'eau transépidermique par jourvaleur(TEWL); L'épaisseur de l'oreille de la souris a été mesurée quotidiennement à l'aide d'un épaisseur - mètre.

ASCH VAPOSCANAppareil de mesure de la perte d'eau percutanée

(c）第3 Jour et jour7 Perte d'eau transépidermique en jours (TEWL) Résultats de la détection. Par rapport au groupe témoin à vecteur soluble,E6795Administration orale en7 Les jours peuvent être considérablement réduitsTEWL. Les données sont incorrectement exprimées en moyenne ± standard (sauf pour8 Groupe d'administration orale quotidiennen = 3En dehors, les autres groupesn = 4).* Après correctionP < 0,05, par rapport au groupe témoin solvant (test de dunnett)

￮Détection du comportement des démangeaisons: Au cours de la7Ciel17: 00 heuresAu lendemain07: 00 heures, placer la souris seule dans la cage de mesure, par2Après la période d'acclimatation horaire, enregistrée par le système de mesure des rayures12Fréquence du comportement de grattage pendant l'heure.

￮Analyse histologique et immunohistochimique: le point final de l'expérience a recueilli le tissu cutané de l'oreille de souris, après fixation au formaldéhyde, encapsulation à la paraffine5 μmTranche, effectuéeH et EColoration (observation de l'infiltration des cellules inflammatoires et de l'épaisseur de l'épiderme), coloration au bleu de toluidine (comptage des mastocytes) etPAR-2Coloration immunohistochimique; Les échantillons de peau humaine sont également effectuésPAR-2Détection immunohistochimique.

￮Analyse par cytométrie en flux: préparation enzymatique de tissus cutanés de l'oreille de souris en suspension unicellulaire, après coloration avec des anticorps fluorescents marqués, parFACS FortesseDétection des éosinophiles, des neutrophiles,CD4⁺TInfiltration de sous - populations de cellules immunitaires telles que les cellules, les basophiles, etc., les résultats étant exprimés en nombre absolu de cellules par millimètre carré de peau de l'oreille.

4. Étude pharmacocinétique: Détection in vivo chez la sourisE6795Fraction libre de plasma, fraction libre de sang total et sang-Rapport plasmatique, évaluer ses caractéristiques d'absorption et de distribution systémique.

5. Analyse sélective: par Panel sélectif kinase etle CEREPPanneau de liaison pharmacologique, détection1 μMet10 μMSous la concentrationE6795Effet inhibiteur sur plusieurs kinases, récepteurs, canaux ioniques, évaluation de leur activité de déscible.

6. Analyse statistique: utilisationGraphPad Prism 7.03Logiciel, avec analyse de variance à un facteur (ANOVA à sens unique) combinéDunnettTest de comparaison multiple pourα = 0,05Pour le niveau de test, les données sont en moyenne±Erreur standard (moyenne±SEM) représente.

Conclusion de l'expérimentation

1. E6795Puissant et sélectifPAR-2Activité inhibitrice, détermination du flux de calcium cellulaireIC₅₀La valeur est6,56 nM, ouiPAR-1Il n'y a pas d'effet inhibiteur et l'activité de désactivation est extrêmement faible dans un large éventail de kinases et de panneaux pharmacologiques.

2. Affichage pharmacocinétiqueE6795Résorbable par voie orale, bien que le taux de liaison aux protéines plasmatiques soit élevé97,5%Mais de petites quantités de médicaments libres peuvent exercer un effet thérapeutique.

3. Immunohistochimie confirméeADDans les kératinocytes du patientPAR-2Expression élevée chez les personnes en meilleure santé.

4. DansMC903InduiteADDans un modèle de souris,E6795L'administration orale et locale réduit l'infiltration d'éosinophiles, l'administration orale peut réduireTEWLAméliore la fonction de barrière cutanée, l'administration locale peut réduire l'épaisseur de l'oreille.

5. DansNc/Nga ADDans un modèle de souris,2 % E6795La crème peut réduire l'épaisseur de l'épiderme, l'infiltration de mastocytes et le comportement de grattage, améliorant les performances histologiques liées à la dermatite.

6. E6795Par inhibition sélectivePAR-2Signal, ciblageADLes trois noyaux de la physiopathologie (inflammation, démangeaisons, dysfonctionnement de la barrière) ont le potentiel d'être des médicaments thérapeutiques locaux peu invasifs et rentables.