Ciblant la livraison de gènes dans les cellules difficiles à transfecter, les chercheurs de l'Université nationale de Singapour ont créé un système chimérique de livraison de gènes utilisant la technologie des vésicules microcellulaires (mcvt), qui utilise un extrudeur de liposomes de la société américaine genizer et a publié les résultats dans la revue Nanoscale. Le nom complet de l'original est: Micro cell vesicle technology (mCVT): a novel hybrid system of gene delivery for hard-to-transfect (HTT) cells. DOI

Dans cette étude, l'équipe de recherche de l'Université nationale de Singapour a présenté un nouveau système de plate - forme de livraison de gènes chimérique basé sur la technologie de vésicule microcellulaire mcvt. Ce système de plate - forme de livraison de gène, formé par la fusion des membranes cellulaires et des lipides cationiques, a été utilisé pour améliorer l'efficacité de la transfection des cellules htt difficiles à transfecter. Les composants de la membrane cellulaire des vésicules microcellulaires confèrent une spécificité d'endocytose à l'ensemble du complexe, réduisant la Cytotoxicité du complexe lors de la transfection, tandis que les lipides cationiques sont responsables de la liaison au matériel génétique tout en assurant l'intégrité structurelle des mcvts.

Contexte

La livraison de gènes est le processus d'introduction d'ADN étranger dans les cellules eucaryotes. Comme la transmission de gènes thérapeutiques ou fonctionnels pour modifier les processus cellulaires dans la recherche fondamentale (par exemple, la découverte de médicaments et la recherche mécaniste sur les protéines fonctionnelles) et les applications cliniques (par exemple, la thérapie génique). Une transfection génétique efficace nécessite non seulement l'introduction réussie d'acides nucléiques étrangers dans la cellule, mais également leur transport et leur expression ultérieurs dans la cellule. C'est une tâche difficile car les molécules d'ADN elles - mêmes sont chargées négativement et sont donc très difficiles à internaliser par les cellules sous leur forme conventionnelle. En conséquence, il y a eu un grand intérêt pour le développement de systèmes efficaces de transmission des gènes. Au cours des dernières décennies, un grand nombre de systèmes de vecteurs ont été explorés, allant des systèmes de distribution à base de virus aux vecteurs non viraux. Bien que l'efficacité de transfection des vecteurs de distribution de gènes non viraux soit relativement faible, elle est prometteuse en termes de sécurité et d'acceptation clinique, les systèmes lipidiques cationiques et les plates - formes à base de polymères en étant les principaux exemples. Le tableau 1 résume les principaux avantages et inconvénients des réactifs ou méthodes de transfection couramment utilisés à l'heure actuelle.

Un système idéal de distribution de gènes non viraux devrait être capable de délivrer efficacement les molécules d'ADN requises dans un type cellulaire spécifique avec une Cytotoxicité minimale pour assurer une expression maximale du gène cible. Cependant, à notre connaissance, il est clair que les réactifs de transfection actuellement disponibles dans le commerce ne répondent pas à ces critères, en particulier lorsqu'ils sont utilisés pour transfecter des cellules difficiles à transfecter (htt).

Les cellules htt comprennent généralement des cellules primaires, des cellules souches embryonnaires et certaines lignées cellulaires immortalisées telles que 3T3 - L1 (pré - Adipocytes murins), U937 (monocytes humains), jurkat (lymphocytes T humains), HUVEC (cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines), etc. Selon les statistiques, l'efficacité de la transfection plasmidique des cellules htt avec des réactifs disponibles dans le commerce ne dépasse souvent pas 25%. L'une des raisons de la faible absorption de substances étrangères et de plasmides par les cellules htt est leur faible activité métabolique. De plus, ces cellules sont généralement très sensibles aux perturbations cellulaires induites par les réactifs de transfection utilisés, susceptibles d'entraîner une Cytotoxicité et éventuellement la mort cellulaire.

Récemment, une attention considérable a été accordée au fait que les systèmes de délivrance d'origine cellulaire ont le potentiel de livrer des molécules de cargaison actives à des sites cibles dans une certaine mesure spécifique. En fait, de nombreuses études ont exploré l’utilisation de systèmes de délivrance de médicaments dérivés des monocytes (DDS) pour la livraison dirigée de médicaments de chimiothérapie et d’adn plasmidique (adnp) dans les tumeurs, ou l’utilisation de DDS dérivés des globules rouges pour prolonger la circulation sanguine et la livraison dirigée d’adnp dans les cellules sanguines. Il est supposé que la rétention des composants de la membrane cellulaire de la cellule mère donnerait à ces systèmes d'administration de médicaments à base de cellules la capacité de reconnaître des cellules cibles spécifiques, peut - être facilitée par l'évasion de la capacité de reconnaissance du système immunitaire du corps.

Malgré les implications thérapeutiques importantes, le plein potentiel de DDS à base de cellules pour la livraison de gènes reste largement inexploité à ce jour. Les principaux défis à relever comprennent les processus fastidieux et à faible débit d'isolement / production de DDS d'origine cellulaire (par exemple, sous forme d'exosomes) et les techniques sous - optimales de chargement / recombinaison de gènes. Ainsi, alors que ces systèmes semblent avoir des avantages en termes de ciblage interne, ils ont de grandes limites en termes de rendement et d'efficacité de chargement de adnp. Ainsi, pour surmonter ces contraintes, nous proposons ici de développer un nouveau système chimérique de délivrance de gènes, composé d'un composant membranaire cellulaire pour renforcer l'internalisation des cellules cibles et d'un composant lipidique cationique pour améliorer le chargement de l'adnp.

Dans cette étude, nous décrivons le développement de la technologie des vésicules microcellulaires (mcvts), une nouvelle plate - forme de livraison hybride obtenue par fusion de lipides cationiques avec la membrane cellulaire. Pour la production de mcvts, les cellules sont d'abord traitées avec une solution aqueuse hypotonique pour obtenir des cellules fantômes (CG sans cytoplasme dans les organites), comme décrit par Goh et al. La solution hypotonique forme de brèves ouvertures dans la membrane plasmique, permettant l'élimination du contenu à l'intérieur des cellules tout en préservant l'intégrité de la membrane plasmique. Le CG de différentes cellules en suspension dans un milieu aqueux a été utilisé pour hydrater des films minces de lipides dotap séchés, puis extrudés à l'aide d'un extrudeur de liposomes fournissant des mcvts de taille hydrodynamique moyenne et de potentiel Zeta similaires à ceux des liposomes dotap extrudés. Dans cette étude, nous avons démontré que les mcvts sont capables de se complexer avec le plasmide et d'être internalisés par les cellules cibles, avec une Cytotoxicité minimale. Fait intéressant, lorsque les mcvts produits à partir de différents types cellulaires ont été comparés in vitro, ils ont montré une efficacité de transfection significativement plus élevée pour le type de cellules dont les mcvts sont issus.

Méthodes et résultats

Les cellules fantômes (CG sans cytoplasme et Membrane organite) sont préparées pour assurer la répétabilité et la sécurité des mcvts.

Méthode et résultats légèrement

Production et caractérisation des mcvt.

Semblable à la production de liposomes, la méthode de film mince de lipide est employée pour produire mcvts. Les films dotap sont hydratés avec le CG pour former de grands liposomes polymoléculaires qui enveloppent le CG. Une telle suspension est extrudée et le sérum de CG contient des lipides dotap (comme représenté sur la figure 3a). En suivant la méthode précédemment établie par notre groupe, il a été démontré qu'après extrusion, les mcvts ainsi produits sont constitués par la fusion des membranes lipidiques et CG. En général, la distribution de la taille de la mcvt est similaire à celle des liposomes. Pour démontrer la robustesse et la polyvalence de cette méthode dans diverses lignées cellulaires, les mcvt ont été fabriqués à l'aide de CG provenant de différentes lignées cellulaires, telles que certaines cellules htt (c. - à - D. 3T3 - L1) et des cellules non cancéreuses (c. - à - D. hek293 et raw264.7). Comme le montre la Figure 3B, la taille hydrodynamique et la PDI des différents mcvt sont généralement de l'ordre de 400 nanomètres (PDI ∼ 0,4), comme pour les liposomes dotap (PDI ∼ 0,2) produits par la même méthode d'extrusion. Sur la figure 3c, des valeurs similaires du potentiel Zêta (de l'ordre de + 30 MV à + 40 MV) ont été observées pour différentes formulations, ce qui suggère que cette méthode est généralement applicable aux CG produites à partir de différentes lignées cellulaires. Il est intéressant de noter que lorsque mcvt3t3 - L1 est couplé à un adnp, sa distribution de taille est similaire à celle des mcvt non couplés, tandis que le potentiel Zêta global devient négatif, ce qui peut indiquer un succès du couplage (car l'adnp chargé négativement neutralise les mcvt chargés positivement).

A. schéma de mcvts impliquant la fusion de fantômes cellulaires et de liposomes fabriqués à partir de films minces hydratés.

B. La taille hydrodynamique des différents mcvt et mcvt3t3 - L1 avec le plasmide est comparée à celle des liposomes dotap. Tous les mcvt ont une taille inférieure à 500 nanomètres.

C. potentiel Zeta de mcvts différents et mcvt3t3 - L1 avec plasmide par rapport aux liposomes dotap. Tous les mcvt ont un potentiel Zeta supérieur à + 30 MV, à l'exception du mcvt3t3 - L1 avec de l'ADN plasmidique (5 µg), qui présente un potentiel Zeta négatif en raison de l'interaction avec l'ADN plasmidique. Les données représentent une moyenne ± SD (n = 3).