Utiliser le pointLUNA-FX7 ™ Compteur automatique de cellules pour optimiser l'évaluation des spermatozoïdes

Mots clés: comptage automatique des cellules, évaluation des spermatozoïdes basée sur l'image, comptage cellulaire, évaluation de la survie, double coloration

1 Introduction

L'évaluation des spermatozoïdes (également appelée analyse du sperme) joue un rôle important dans le jugement de la fertilité masculine. Bien qu'il ne soit pas une mesure directe de la fertilité, la fertilité masculine a un impact important sur la fertilité humaine et la reproduction animale, d'où l'évaluation des spermatozoïdes.

Actuellement, l'évaluation des spermatozoïdes peut être effectuée par cytométrie de flux et des outils d'analyse basés sur des images. Point pour Luna - fx7 ™ Les appareils automatisés tels que les compteurs de cellules automatiques peuvent utiliser des images pour analyser rapidement et facilement les échantillons de sperme. Cependant, en raison de la morphologie et des caractéristiques uniques des spermatozoïdes par rapport aux cellules de mammifères, il est nécessaire d'optimiser les paramètres d'analyse et de sélectionner les colorants appropriés.

Cette étude a effectué une analyse comparative de colorants fluorescents tels que sybr14, Acridine Orange (Ao) et Iodure de Propidium (PI) pour optimiser la composition ponctuelle Luna - fx7. ™ Capacité d'évaluation des spermatozoïdes. Cette étude visait à évaluer l'efficacité de différentes combinaisons de colorants et à optimiser les paramètres d'évaluation des spermatozoïdes.

2 Méthodes et matériaux

2.1 Préparation des échantillons

Décongeler des échantillons de sperme congelé de bovins et remplacer le tampon par du PBS. Les échantillons de sperme sont dilués dans du PBS dans un rapport d'environ 1: 20 à 1: 40, selon les circonstances de l'échantillon.

2.2 Coloration fluorescente

1. Mélange:

Spermatozoïdes dans 18 μl de PBS

2 μl de colorants fluorescents verts et rouges mélangés

2. Incuber à 37 ° C pendant 10 minutes

3. Chargez l'échantillon à la lame appropriée

4. Utilisez le point pour Luna - fx7 ™ Effectuer une analyse

Tableau 1. Points dans Luna - fx7 ™ Paramètres optimisés pour l'évaluation des spermatozoïdes en mode avancé

3 Protocole de comptage cellulaire et combinaison de colorants pour optimiser l'évaluation des spermatozoïdes

résumé: la double coloration sybr14 / pi vs Ao / pi est appropriée pour l'évaluation de la motilité des spermatozoïdes, mais sybr14 / pi se comporte mieux.

Point pour Luna - fx7 ™ Le Protocole par défaut a été optimisé pour les cellules de mammifères communes, mais l'évaluation des spermatozoïdes nécessite des paramètres tels que le niveau d'exposition, la taille des cellules et la sensibilité à la désagglomération. Par exemple, la taille minimale de recherche a été ajustée de 3 µm à 7 µm et la sensibilité de désagglomération de 5 à 7 pour améliorer les performances de détection (tableau 1). En outre, les niveaux d'exposition pour les teintures sybr14 / PI et Ao / PI ont été fixés à GF 6 et RF 9, respectivement.

Sur cette base, nous avons effectué une analyse comparative des méthodes de coloration sybr14 / PI et Ao / pi. Compte tenu de l'efficacité connue de la coloration sybr14 / pi dans l'évaluation des spermatozoïdes, nous nous sommes concentrés sur la présentation de la coloration Ao / pi. Les résultats suggèrent que les deux méthodes de coloration peuvent être utilisées pour l'évaluation des spermatozoïdes (Figure 1). Cependant, l'applicabilité de sybr14 à la coloration des spermatozoïdes est supérieure à celle de Ao, ce qui suggère que les caractéristiques chimiques de sybr14 pourraient être plus appropriées pour cette application.

Figure 1. Images fluorescentes de spermatozoïdes colorés avec deux colorants différents (sybr14 / PI et Ao / pi). Cette image combinée montre les images de champ clair, de lumière verte, de lumière rouge et de marquage après analyse. L'image marquée est une image composite de canal fluorescent, où les cercles rouges représentent les cellules mortes et les cercles verts les cellules viables.

4 conclusion

Cette étude a révélé que les méthodes de coloration sybr14 / PI et Ao / pi pouvaient être utilisées pour évaluer la survie des spermatozoïdes, mais que sybr14 / pi fonctionnait mieux. En outre, l'ajustement du niveau d'exposition et d'autres paramètres est essentiel à la performance globale de détection. Malgré le point Luna - fx7 ™ Il n'est pas spécifiquement optimisé pour les échantillons de sperme, mais il fournit toujours un protocole rapide et pratique pour l'évaluation des spermatozoïdes grâce à l'optimisation des proportions de dilution d'échantillon et des conditions d'imagerie recommandées.