Méthodes de comptage cellulairePour:De la plaque de comptage au compteur de cellules entièrement automatique

De nombreuses expériences et tests courants nécessitent que les scientifiques calculent d'abord avec précision le nombre ou la densité des cellules. Ces opérations comprennent un entretien simple de la culture cellulaire (par exemple, le passage cellulaire) ainsi que des expériences quantitatives (par exemple, QPCR). Le comptage des cellules peut être fait par un certain nombre de méthodes, et cet article fournira un aperçu complet de ces méthodes et de leurs avantages et inconvénients.

1 Plaque de comptage / cellules sanguinescomptageLe dispositif

Utilisation de cellules sanguinescomptageLe dispositifLors du nettoyage d'abord avec de l'alcool à 70% et du papier lentillecomptageLe dispositif, puis placez délicatement la lame sur la plaque de comptage. Si les lamelles sont correctement placées, on peut observer le phénomène des anneaux de Newton (motifs colorés en anneaux concentriques). Prenez une petite portion de la suspension cellulaire avec une pipette, placez la pipette sur le bord de la plaque de comptage et laissez la suspension couler par capillarité dans la Chambre de comptage. Si l'activité cellulaire doit être détectée, le bleu Trypan doit être mélangé dans la suspension cellulaire dans un rapport de 1: 1 avant d'être ajouté à la Chambre de comptage.

Cellules sanguinescomptageLe dispositifSont les premières méthodes spécialisées pour obtenir un comptage précis des cellules, avec des grilles spéciales sur les plaques de comptage. En général, les grands carrés sont de 1 mm x 1 mm et sont divisés en petits treillis de 0,05 mm x 0,05 mm. Le bord de la Chambre de comptage est conçu pour fixer la lame à 0,1 mm au - dessus de la grille de marquage, formant ainsi une zone de volume connu.

Après la mise au point du microscope sur une zone de la Chambre de comptage, utilisezCompteurLes cellules sont comptées. Des zones de 1 millimètre carré (100 nanolitres) sont généralement prises et comptées avec un objectif 4x ou 10x, mais le choix spécifique dépend de la taille des cellules et de la densité dans la suspension. Ce processus est généralement répété dans quatre zones différentes de 1 millimètre carré et les résultats sont moyennés. Si l'activité cellulaire est détectée, les cellules vivantes et mortes doivent être comptées séparément, où les cellules mortes sont colorées au bleu Trypan en raison de dommages à la membrane.

Figure 1 le sangLes cellulesSchéma de la grille de la plaque de comptage

Avantages et inconvénients

Le comptage manuel est le moyen d'économiser sur votre budget, mais c'est aussi le plus long et le plus fastidieux. La fiabilité est faible en raison d'erreurs humaines, en particulier lorsque plusieurs comptages sont effectués en continu. En outre, un comptage fréquent peut également entraîner une fatigue oculaire. Si le laboratoire ne compte que de temps en temps et ne nécessite pas de haute précision, les cellules sanguinesCompteurC'est un bon choix. Mais cette approche semble inadéquate lorsqu'elle nécessite des comptages fréquents, une précision accrue ou des applications à haut débit. De plus, le comptage manuel rend difficile la distinction entre les différents types de cellules dans la suspension, à moins que les types de cellules ne diffèrent considérablement en taille ou en forme.

2 Cellules automatiquesCompteur

Cellules automatiquesCompteurUne alternative rapide, facile et automatisée au comptage manuel. Ils sont basés sur les cellules sanguinesCompteurLe même principe, l'opération est réalisée en comptant les cellules plusieurs fois dans une zone connue et en faisant la moyenne. Ces dispositifs peuvent également différencier les cellules vivantes des cellules mortes par des méthodes d'exclusion de colorant telles que le bleu Trypan. Cellules automatiquesCompteurIl peut s'agir d'un appareil autonome ou connecté à un ordinateur pour une utilisation. La majoritéCompteurEn plus de fournir des informations telles que le nombre de cellules, vous pouvez également compter la taille des cellules.

Comptage des cellules fluorescentesLe mètre(par exemple Luna - fl ™ Double comptage de cellules fluorescentesLe mètre), permet de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes et de les compter en utilisant des colorants courants (par exemple, l'acridine orange et l'iodure de Propidium). Ces types de comptage cellulaireLe mètreExcellent également dans le comptage des cellules dans les cultures qui peuvent être contaminés par des fragments non cellulaires (par exemple, les cellules primaires), car les colorants peuvent distinguer clairement les cellules.

Avantages et inconvénients

automatiqueCompteurConvient pouruniverselLe comptage cellulaire et la détection de l'activité. Il est simple à utiliser et moins coûteux, ce qui réduit considérablement la quantité de travail pour le comptage manuel. automatiqueCompteurPrécis et fiable, mais il peut être difficile de compter des cellules de forme irrégulière, très petites, extrêmement minces en suspension ou contenant plusieurs types de cellules à distinguer. Pour la plupart des types de cellules et des applications, automatiqueCompteurFournit des performances de comptage efficaces.

3 CoulterCompteur

CoulterCompteurAu lieu d'un instrument optique, les cellules sont comptées en mesurant les variations de résistance des microcanaux. La résistance des cellules est supérieure à celle de la solution d'électrolyte en suspension et augmente brièvement la résistance lorsque les cellules traversent le canal, un changement qui augmente avec la taille des cellules. CoulterCompteurFonctionnement similaire à automatiqueCompteur, mais vous devez exécuter un test vide avant utilisation et rincer l'appareil après utilisation.

Avantages et inconvénients

KurtCompteurRapide et capable de compter avec précision les cellules de différentes tailles, il est souvent utilisé pour le comptage des cellules sanguines dans les hôpitaux. Cependant, il ne peut pas distinguer les cellules vivantes des cellules mortes, ni compter avec précision les cellules qui forment des grappes. De plus, ses exigences de maintenance sont élevées.

4 Cytomètre de flux

La cytométrie en flux est généralement utilisée pour des analyses cellulaires plus détaillées, équipées de techniques de détection par fluorescence qui détectent les composants intracellulaires marqués. Tous les cytomètres en flux ne sont pas capables de compter les cellules, mais les cytomètres en flux dotés de capacités de mesure volumétrique fournissent un comptage très précis des cellules et peuvent différencier les types de cellules par des anticorps marqués par fluorescence.

Avantages et inconvénients

La cytométrie en flux est puissante, mais coûteuse, généralement supérieure à 40 000 $à 100 000 $, et est donc rarement utilisée pour le comptage cellulaire régulier.

5 Autres méthodes de comptage cellulaire

Spectrométrie occasionnellement utilisée pour estimer la densité cellulaireDegrés. Comme les cellules sont turbides, la lumière à travers la boîte de couleur diminue à mesure que la densité cellulaire augmente. Cependant, cette méthode n'est pas fiable car le spectromètre ne compte pas directement les cellules, ne mesure que l'Absorbance et d'autres variables dans la suspension peuvent influencer l'Absorbance.

La méthode de culture est une autre méthode de comptage qui ne s'applique qu'aux cellules formant des colonies (par exemple, les bactéries). Après que la suspension cellulaire ait été diluée et striée à la boîte de pétri, le nombre de colonies a été compté pour calculer la densité cellulaire de la suspension originale. Mais en raison de la nécessité d'attendre la croissance des colonies, la méthode de culture est la méthode la plus lente.

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