Manuel d'utilisation expérimental du kit ELISA pour facteur de croissance endothélial vasculaire humain a (VEGF - a)

BS - 9809 Kit ELISA pour facteur de croissance endothélial vasculaire humain a (VEGF - a)

I. Aperçu du produit

Ce kit utilise la méthode ELISA (double anticorps Sandwich Enzyme linked immunosorption) et est dédié à la détection de la concentration de VEGF - a dans des échantillons de sérum humain, de plasma, d'homogénats de tissus, de surnageants de cultures cellulaires, etc. Pour usage scientifique seulement.

II. Composition du kit

Les pré - paquets sont microplaqués: 12 puits x 8 bandes (96 puits) ou 12 puits x 4 bandes (48 puits) et les pré - paquets sont piégés par des anticorps anti - VEGF - a.

Produit standard: poudre lyophilisée, à diluer avec une dilution de produit standard (gradient de concentration recommandé: 10, 3,33, 1,11, 0,37, 0,12, 0,04, 0 ng / ML).

Détection d'anticorps - hrp: anticorps anti - VEGF - a marqué à la peroxydase de raifort.

Tampon de lavage: 20 x solution concentrée à diluer 1: 20 avec de l'eau distillée.

Solution de substrat: TMB Color render A / B, mélanger 1: 1 avant utilisation et consommer dans les 15 minutes.

Liquide de terminaison: solution 2m.

Dilution d’échantillon: pour diluer des échantillons à haute concentration.

Membrane de scellement: 2 feuilles pour sceller les microplaques en incubation.

Iii. Principes expérimentaux

Le VEGF - a se lie à l'anticorps capté pré - encapsulé pour former un complexe "anticorps - antigène"; Après addition des anticorps de détection marqués HRP, une « structure sandwich » est formée. Les substances non liées sont éliminées par lavage, le substrat TMB est ajouté pour rendre la couleur (bleu) et le liquide de terminaison devient jaune après la fin de la réaction. La longueur d'onde de 450 nm détermine l'Absorbance (valeur OD) et la concentration est proportionnelle à la valeur od.

Iv. Étapes expérimentales

Préparation des échantillons

Sérum / plasma: centrifugation pour éliminer les particules et éviter l'hémolyse; 2 - 8 ℃ conserve ≤ 48 heures, la conservation à long terme nécessite - 20 ℃ / - 80 ℃ (évitez la congélation et la dégel répétées).

Éclaircissement cellulaire: centrifuger pour enlever le déblaiement et éviter de contenir des concentrations élevées d'agents protéases.

Préparation des réactifs

Liquide de lavage: lorsque le liquide de lavage concentré cristallise à température ambiante, il est dilué à 1: 20 après dissolution au bain - Marie à 40 ° c.

Standard: dilué après solubilisation, maintenant utilisé.

Substrat: TMB A / B liquide 1: 1 mélangé, conservé à l'abri de la lumière.

Processus opérationnels

Dosage: ajouter 100 µl d'étalon / échantillon par puits et incuber à 37°c pendant 90 minutes.

Lavage: égoutter le liquide à l'intérieur du trou et laisser tremper 1 minute / fois avec le liquide de lavage, répéter 3 fois.

Ajout d'anticorps de détection: 100 µl d'anticorps marqués HRP sont ajoutés par puits et incubés à 37°c pendant 60 minutes.

Lavage: arrêt synchrone 2.

Rendu des couleurs: 90 µl de substrat TMB sont ajoutés par puits et incubés à 37 ° C à l'abri de la lumière pendant 15 - 20 minutes.

Terminaison: 100 µl de liquide de terminaison sont ajoutés par puits et la valeur de do est mesurée dans les 30 minutes suivant le mélange.

Calcul des résultats

La courbe standard est tracée en abscisse avec la concentration du standard (ng / ML) et en ordonnée avec la valeur od.

La concentration est calculée à partir de la courbe de substitution de la valeur od de l'échantillon, multipliée par un multiple de dilution pour obtenir le résultat.

V. précautions

Conservation du réactif: le kit non utilisé nécessite une conservation à l'abri de la lumière de 2 à 8 ℃, la date d'expiration est de 6 mois; Les produits standard de remise en solution peuvent être divisés en stockage par congélation, évitant la congélation et la dégel répétées.

Manipulation des échantillons: Évitez les échantillons contenus et Empêchez l'activité HRP.

Spécifications de fonctionnement: pipetage nécessaire, éviter les bulles d'air; Lavage nécessaire pour éviter la contamination croisée.

Protection de sécurité: le liquide de terminaison contient un acide fort et doit être manipulé avec des gants.

Vi. Résultats escomptés

Sensibilité: ≤ 1,54 pg / ML (selon les instructions).

Plage de détection: la plage typique est de 3,12 à 200 pg / ML et certains kits sont étendus à 62,5 à 2000 pg / ML.

Répétabilité: < 10% et < 15% des coefficients de variation intra / Inter - plaques, respectivement.

Vii. FAQ

Q: le rendu des couleurs est - il trop clair ou trop profond?

A: ajuster le multiple de dilution de l'échantillon ou le temps d'incubation; Assurez - vous que le substrat est fraîchement formulé.

Q: la courbe standard est - elle linéaire?

A: Vérifiez l'opération de remise en solution et évitez les bulles d'air; Remplacez la tête d'aspiration de la pipette.

Remarque: ci - dessus est pour référence seulement, ce produit est pour l'usage scientifique seulement, pas comme données réelles, l'expérience doit suivre strictement les instructions ou consulter l'enseignant technique.

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