Kit de détection ELISA pour interféron Gamma humain (IFN - γ) fiche technique

BS - 0033 Kit ELISA pour interféron Gamma humain (IFN - γ)

I. principe de détection

Ce kit utilise le test d'immunoadsorption enzymatique (ELISA) par la méthode sandwich à double anticorps. Les anticorps monoclonaux anti - IFN - Gamma humains ont été pré - encapsulés dans des microplaques, puis des échantillons, des étalons et des anticorps de détection marqués à la biotine ont été ajoutés pour former un complexe anticorps - antigène - enzyme. Après lavage, la streptavidine (streptavidin - HRP) marquée à la peroxydase de raifort est ajoutée pour se lier, la couleur étant révélée par le substrat TMB. Les nuances de couleur étaient positivement corrélées à la concentration d'IFN - gamma dans l'échantillon, avec une analyse quantitative utilisant un étalon enzymatique pour déterminer l'Absorbance (valeur OD).

II. Composition du kit

Composant 96 configuration de trou 48 configuration de trou conditions de sauvegarde

Pré - emballé par microplaque 12 puits x 8 bandes 12 puits x 4 bandes 2 - 8℃

Standard lyophilisé 1 tube 1 tube 2 - 8 ℃ (après remise en solution - 20 ℃)

Anticorps marqués à la biotine 100 μl 100 μl 2 - 8 °C (à l'abri de la lumière)

Streptavidine - hrp 100 μl 100 μl 2 - 8 °C (à l'abri de la lumière)

Dilution de l'échantillon 30ml 15ml 2 - 8 ℃

20 × tampon de lavage 20 ml 10 ml 2 - 8 ℃

TMB substrat liquide 10ml 5ml 2 - 8 ℃ protégé de la lumière

Liquide de terminaison 10ml 5ml 2 - 8 ℃

Film d'étanchéité 4 feuilles 2 feuilles température ambiante

Iii. Exigences relatives aux échantillons

1. Types d'échantillons

Sérum / plasma: Anticoagulation avec EDTA ou héparine pour éviter l’hémolyse.

Éclaircissement de la culture cellulaire: la centrifugation élimine les particules et évite la congélation et la dégel répétées.

Autres fluides biologiques: par exemple, liquide céphalo - rachidien, ascite thoracique, test post - clarification nécessaire.

2. Traitement des échantillons

Ratio de dilution: sérum / plasma recommandé une dilution de 1: 5 (échantillon: dilution = 1: 4), surnageant cellulaire recommandé une dilution de 1: 2.

Conditions de conservation: conservation à court terme (≤ 7 jours) 2 - 8 ℃, à long terme besoin de stockage de congélation à - 80 ℃ (éviter la congélation répétée et la dégel).

Iv. Étapes expérimentales

1. Préparation des réactifs

Liquide de lavage: diluer le concentré 20x dans un liquide de travail 1x (par exemple 20ml de concentré + 380ml d'eau) avec de l'eau distillée.

Redissolution des étalons: les étalons lyophilisés sont ajoutés avec 1 ml de dilution des étalons et laissés au repos pendant 15 minutes pour être combinés avec une solution mère hautement concentrée.

Dilution en gradient: prendre 7 tubes EP, ajouter 500 µl de dilution par tube, transférer 500 µl de la solution mère à un tube de mélange, dilution spécifique séquentielle (exemple: 1000 → 500 → 250 → 125 → 62,5 → 31,25 → 15625 pg / ML).

2. Dosage et incubation

Ajouter 100 µl d'étalon par puits ou d'échantillon après dilution (détection poreuse recommandée).

37 ℃ incuber à l'abri de la lumière pendant 90 minutes, sceller le film de plaque.

3. Lavage

Retirez le liquide à l'intérieur du trou et lavez 3 fois avec 1x liquide de lavage, laissez infuser 1 minute à chaque fois et séchez.

4. Rendu des couleurs et terminaison

100 µl d'anticorps marqué à la biotine sont ajoutés par puits (préalablement dilués avec une dilution d'anticorps 1: 100) et incubés à 37°c pendant 60 minutes à l'abri de la lumière.

Après lavage, 100 µl de Streptavidine - hrp (préalablement dilué avec une dilution ABC 1: 100) sont ajoutés par puits et incubés à 37°c pendant 30 minutes à l'abri de la lumière.

Après lavage, 100 µl de solution de substrat TMB sont ajoutés par puits à 37°c à l'abri du rendu de la lumière pendant 15 - 20 minutes.

L'addition de 50 µl de liquide de terminaison par puits termine la réaction (la solution est jaunâtre par le bleu).

5. Détermination

La valeur de la do à une longueur d'onde de 450 nm (longueur d'onde de référence 570 - 630 nm) a été déterminée avec un étalon enzymatique en 30 minutes.

V. Calcul des résultats

La courbe standard (ajustement à quatre paramètres) est tracée en abscisse pour la concentration du standard et en ordonnée pour la valeur od.

À partir de la valeur de do de l'échantillon, la concentration réelle est calculée au moyen de l'équation de régression, si l'échantillon est dilué, il faut multiplier par un multiple de dilution.

Vi. Indicateurs de performance

Paramètres indicateurs

Sensibilité ≤ 1,0 pg / ml

Plage de détection 15,63 – 1000 pg / ml

CV < 10% dans la plaque de précision

Taux de récupération 83% - 113%

Spécificité sans réaction croisée avec l'il - 2 humaine, l'il - 4, etc.

Vii. Précautions

Conservation des réactifs: les lamelles non utilisées doivent être scellées et conservées à 2 - 8 ℃, pour éviter l'humidité; Le substrat TMB doit être protégé de la lumière.

Traitement des échantillons: évitez d'utiliser des échantillons hémolytiques et hyperlipidiques; Les échantillons à forte concentration nécessitent une pré - expérience pour déterminer le multiple de dilution.

Spécifications opérationnelles:

Évitez les bulles lors de l'échantillonnage, la tête du pistolet doit être remplacée.

Le temps d'incubation est strictement contrôlé dans les limites prescrites et empêche l'évaporation.

Contrôle de la qualité: chaque lot d'expérience nécessite un trou vide (s0) et un contrôle négatif.

Conseils de sécurité: le liquide de terminaison contient de l'acide et doit être manipulé avec des gants; Les déchets sont traités selon les risques biologiques.

Viii. Durée de validité

Les kits sont efficaces pendant 6 mois à 2 - 8 ℃, après le déballage des produits standard recommandés pour la congélation à - 20 ℃.

Remarque: ci - dessus est pour référence seulement, ce produit est pour l'usage scientifique seulement, pas comme données réelles, l'expérience doit suivre strictement les instructions ou consulter l'enseignant technique.

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