Instructions pour le kit de détection ELISA de protéine de soja de rat (Daidzein)

BS - 8567 Kit ELISA de protéine de soja de rat (Daidzein)

Présentation du produit

Ce kit utilise une méthode d'immunoadsorption enzymatique compétitive (ELISA) dédiée à la détection quantitative de la teneur en protéine de soja (Daidzein) dans des échantillons biologiques tels que le plasma, le sérum ou les homogénats de tissus de rats. La protéine de soja est un isoflavonoïde naturel avec des activités biologiques telles que l'antioxydation, l'anti - inflammation et la régulation de l'immunité, largement présent dans les légumineuses, dont la détection du contenu est essentielle pour la recherche pharmacologique et l'évaluation nutritionnelle. Ce kit est basé sur le principe de liaison spécifique antigène - anticorps permettant une détection de haute sensibilité par amplification du signal de l'échelle enzymatique et convient aux analyses de routine en laboratoire.

Composition du kit

Les pré - paquets sont microplaqués: 96 puits (12 x 8 puits), les lamelles sont amovibles et les paquets sont munis d'anticorps spécifiques de la protéine de soja.

Standard: 6 gradients de concentration (0,13 – 61,02 ng / ML), poudre lyophilisée, redissolution avec une dilution de standard avant utilisation provisoire.

Marqueur enzymatique: antigène compétitif marqué par la peroxydase de raifort (HRP), conservé à l'abri de la lumière brune.

Substrat chromogène: solution TMB, liquide limpide incolore.

Liquide de terminaison: solution d'acide sulfurique 2m pour terminer la réaction.

Liquide de lavage: 20 x tampon concentré à utiliser après dilution avec de l'eau désionisée.

Dilution de l'échantillon: pour ajuster la concentration de l'échantillon à la plage de détection.

Film d'étanchéité: 2 feuilles pour l'étanchéité des microplaques.

Instructions: 1 exemplaire.

Conditions de stockage

Kit non ouvert: conservation à l’abri de la lumière entre 2 et 8°c, valable 12 mois.

Après ouverture: les normes, les marqueurs enzymatiques et les substrats chromogènes doivent être congelés (- 20 ° c) pour éviter la congélation et la dégel répétées; Microplaques séchées scellées pour la conservation.

Il est interdit de geler le liquide de lavage concentré et d'empêcher le dégagement de cristallisation.

Traitement des échantillons

Échantillons de plasma / sérum: centrifuger immédiatement après le prélèvement (3000 RPM, 10 min), prélever le surnageant, conserver à - 80°c. Évitez l'hémolyse.

Homogénat tissulaire: les tissus sont pesés, l'homogénat de sérum physiologique (1: 9 P / v) est ajouté et le surnageant est prélevé par centrifugation.

Précautions: les glycosides de soja peuvent être présentes à l'état conjugué dans l'échantillon et l'hydrolyse par la bêta - Glucuronidase est recommandée pour améliorer la sensibilité de la détection. Les échantillons doivent être centrifugés (5 000 tr / min, 10 min) ou filtrés (membrane de 0,22 µm) lorsqu'ils sont nuageux.

Étapes expérimentales

1. Préparation des réactifs

Liquide de lavage: diluer 20 x solution concentrée à 1 x avec de l'eau désionisée (par exemple 10 ml de solution concentrée + 190 ml d'eau).

Gradient Standard: le standard lyophilisé est redissous avec une dilution standard, gradient dilué à 0,13, 0,39, 1,17, 3,51, 10,53, 61,02 ng / ML.

Dilution de l'échantillon: diluer l'échantillon à tester dans la plage de détection avec une dilution de l'échantillon (il est recommandé de déterminer les multiples de dilution au préalable).

2. Ajout et incubation

Ajoutez 100 μl d'étalon ou d'échantillon par puits (placez des puits vides avec seulement la dilution de l'échantillon).

Ajouter 50 µl de marqueur enzymatique par puits et mélanger doucement.

Incuber à 37°c à l'abri de la lumière pendant 60 minutes.

3. Lavage

Défaussez le liquide à l'intérieur des puits, ajoutez 350 μl de liquide de lavage par puits, laissez - le sécher après 30 secondes de repos, répétez 5 fois et séchez.

4. Rendu des couleurs et terminaison

100 µl de substrat chromogène sont ajoutés par puits et incubés à 37°c pendant 15 minutes à l'abri de la lumière.

Ajouter 100 μl de liquide de terminaison par puits et mélanger doucement.

5. Détermination

L'Absorbance (valeur OD) est déterminée immédiatement avec un étalon enzymatique à une longueur d'onde de 450 nm, longueur d'onde de référence 630 nm.

Calcul des résultats

Tracé de la courbe Standard: ajustez la courbe logique à quatre paramètres avec la concentration du produit standard (ng / ML) en abscisse et la valeur od en ordonnée (logiciel professionnel recommandé).

Calcul de la concentration de l'échantillon: l'équation de la courbe standard est remplacée par la valeur od de l'échantillon et multipliée par le multiple de dilution pour obtenir la concentration réelle.

Paramètres de performance

Sensibilité: limite de détection 0,13 ng / ML.

Précision: coefficient de variation intra - plaque (CV) < 10%, CV inter - plaque < 15%.

Taux de récupération: 80 à 120% (méthode validée: expérience de récupération augmentée).

Plage linéaire: 0,13 – 61,02 ng / ML, coefficient de corrélation R² ≥ 0,98.

Spécificité: taux de réaction croisée < 5% avec des composés de structure similaire (p. ex., la lignine colorante).

Précautions

Spécifications opérationnelles: éviter le contact des marqueurs enzymatiques et des substrats chromogènes avec les ions métalliques; Il est déterminé dans les 30 minutes suivant le rendu des couleurs, empêchant l'atténuation du signal.

Contrôle de la qualité: chaque lot d'expérience doit contenir des courbes standard et des échantillons de contrôle de la qualité (concentrations élevées, moyennes et faibles recommandées).

Protection de sécurité: le liquide de terminaison contient un acide fort et doit être manipulé avec des gants et des lunettes.

Traitement des déchets: les déchets contenant des enzymes doivent être inactivés avant d'être éliminés.

FAQ

Signal faible: vérifier si le temps d'incubation ou la température est insuffisante; Vérifiez que l'étape de lavage est adéquate.

Valeurs de fond élevées: peut être perturbé par l'absence de lavage ou la matrice de l'échantillon, il est recommandé d'augmenter le nombre de lavages ou d'optimiser le traitement préalable à l'échantillon.

Anomalie de la courbe Standard: lors de la remise en solution des produits standard, vous devez bien mélanger pour éviter que les bulles n'affectent la précision de la concentration.

Remarque: ce produit est destiné à un usage scientifique uniquement et ne constitue pas une base expérimentale. Pour les opérations spécifiques, veuillez respecter les instructions réelles du kit.

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