Résumé: l'absorption du glucose par B. glutamicum se fait principalement par l'intermédiaire du système Mannose phosphotransférase (PTS) qui a une affinité élevée pour le glucose (km = 0,35 mm). On a choisi des mutants capables de tolérer le 2 - désoxyglucose (2dg) et l'absence d'activité de transport du glucose dépendante de la PEP, ces mutants étant capables de croître sur un milieu où le glucose est une seule source et source d'énergie de carbone, le taux de glucose absorbé étant significativement réduit du fait de l'Adoption d'un système de captation non PTS de faible affinité (KS = 11 mm). Les cellules de type sauvage ont été cultivées dans des milieux de différentes pressions osmotiques, avec des taux de consommation de glucose et des taux de croissance spécifiques inférieurs. Les cellules de ces cultures montrent une activité PTS similaire lorsqu'elles sont mesurées dans des conditions standard. Cependant, lorsque les cellules sont resuspendues dans des tampons avec différentes osmolarités, l'activité PTS s'avère être associée à l'osmolarité. Cet effet inhibiteur permet d'expliquer la diminution de l'absorption des sucres et du taux de croissance observée dans le milieu de fermentation hyperosmolaire. Mais les systèmes de transport du glucose non PTS ne sont pas affectés par l'osmolarité du milieu. Une inhibition similaire de la capacité de transport du sucre a été observée dans des conditions de production industrielle avec une augmentation correspondante de l'osmolalité du milieu d'accumulation de glutamate. Ce phénomène limite ainsi le processus de fermentation car une diminution du taux spécifique entraîne une augmentation de la proportion de sucres consommés pour l'entretien cellulaire, accompagnée d'une diminution du rendement en produit.

Mots clés: transport du glucose; Pression osmotique; Fermentation du glutamate; Bacillus glutamate;

Contenu de l'étude:

Effet de l'osmolarité sur la vitalité du système d'absorption du glucose pts

L'activité PTS à l'intérieur de l'osmolalité de 800 mosmol / kg est maintenue constante, après quoi l'activité PTS diminue linéairement avec l'augmentation de l'osmolalité. L'activité PTS à l'osmolalité de 1900 mosmol / kg n'était que de 15% à son maximum.

2, effet de la pression osmotique sur la fermentation du glutamate

L'accumulation d'acide glutamique et de métabolites secondaires entraîne une augmentation significative de l'osmolarité du milieu, qui est encore accentuée par l'addition d'une base (dans ce cas l'ammoniac) pour maintenir le pH constant. Ce phénomène a été observé chez Corynebacterium glutamicum, souche thermosensible 2262, capable d'atteindre des concentrations élevées en produit (acide glutamique > 85 g / l) et une osmolarité supérieure à 2000 mosmol.kg - 1. Le taux de consommation de sucre reste constant pendant les premières heures, puis

Baisse progressive. Pour vérifier si l'affaiblissement de l'activité est associé à une augmentation de l'osmolarité due à l'accumulation de glutamate, on a mesuré la contribution de l'activité PTS à l'absorption totale de sucres, la contribution mesurée chez la bactérie sauvage Corynebacterium glutamicum atcc17965 étant cohérente, soit 4,5 mmol.g-1.h-1. Dans les souches productrices de glutamate, l'absorption totale des sucres est plus rapide, ce qui indique une activité osmotique plus élevée. Les taux d'absorption de glucose mesurés dans des conditions non stressantes indiquent que la perméase contribue jusqu'à 25% de l'absorption totale de glucose chez Corynebacterium glutamicum 2262. La détermination de l'effet inhibiteur du stress osmotique sur l'activité PTS selon la méthode de mesure in vitro du système de transport PTS permet, dans des conditions de supplémentation en glucose (contribution négligeable de la perméase) (faible taux de glucose résiduel, c'est - à - dire inférieur à 2 g·l - 1), de constater Une diminution de la consommation de glucose très proche de la diminution prévue de l'activité PTS (Figure 3A). Lorsque l'on utilise une stratégie de supplémentation en glucose qui maintient des concentrations plus élevées (50 g·l - 1), l'amélioration de la consommation de glucose peut être due à l'activité de la perméase et à la saturation élevée de ce système par le glucose présent dans le réacteur (figure 3b).Apparaît plus tôt, comme l'acide lactique.

3, effet sur le rendement en acide glutamique

L'une des conséquences de la diminution de l'activité métabolique une fois l'osmolarité dans le milieu augmentée est une diminution significative de la production de glutamate en fin de fermentation. Une diminution du taux de consommation de glucose entraîne une diminution du rendement en glutamate due à une augmentation de la proportion de glucose convertie en CO2. La production de CO 2 reste sensiblement constante tout au long de la phase de production, ce qui indique que le besoin d'énergie biochimique provenant du catabolisme des sucres pour l'entretien des cellules est constant, ce besoin étant proportionnel à la biomasse à l'intérieur du fermenteur,

La diminution du taux de consommation spécifique de sucre nécessite donc une augmentation de la proportion de sucre utilisée. Calculé en utilisant le coefficient d'entretien de Corynebacterium glutamicum de 0,6 mmol de glucose / g de cellules / h, la proportion de glucose nécessaire à l'entretien cellulaire augmente de 15% de la consommation totale de sucre au stade initial de la production de glutamate à 40% lorsque l'osmolarité est la plus élevée en fin de fermentation (Figure 4). La baisse du rendement en glutamate observée à la fin de la fermentation est compatible avec les changements dans le flux métabolique du carbone qui maintient la demande. En fonction de la diminution de la demande métabolique en oxygène lors de l'affaiblissement de l'activité métabolique, le contrôle de la concentration en sucres résiduels en fonction des variations de l'oxygène peut restaurer une partie de la perte de rendement.

4. Discussion

Cet article illustre que l'inhibition tardive de la fermentation du glutamate est directement liée à l'influence contrôlée de l'accumulation du produit et de l'environnement osmotique sur la capacité d'absorption du sucre. Ce phénomène n'est pas dû à une modification du niveau d'expression des gènes, mais à une modification de l'activité biochimique du système de transport dans des conditions de stress osmotique. De plus, cet effet est réversible car une fois le stress osmotique éliminé, les cellules lavées peuvent encore retrouver leur capacité à transporter le sucre. De même, lorsque remis en suspension dans un tampon hypertonique, la capacité de transport du sucre des cellules en croissance normale est également considérablement réduite. Avec l'augmentation de l'osmolarité, cet effet physiologique entraîne une diminution de la consommation de sucre et un ralentissement du taux métabolique. Étant donné que les besoins énergétiques pour maintenir la biomasse restent les mêmes et que, dans de nombreux cas, il faudra ajouter de l'énergie supplémentaire pour répondre à la lutte contre de telles pressions, cela entraînera également une baisse du rendement du produit. Une part croissante de la consommation de sucre sera utilisée pour la production d'énergie et sera donc perdue sous forme de CO2 au détriment de la réduction des produits. Pour la fermentation du glutamate, le rendement et le rendement diminuent significativement avec l'augmentation de l'osmolarité du milieu. Les mécanismes biochimiques qui déclenchent une diminution de la capacité de transport de la protéine PTS restent à déterminer, mais peuvent être associés à des changements structurels dans le complexe protéine / membrane. Les souches produisant plus efficacement ou plus rapidement du glutamate atteindront plus rapidement le seuil de pénétration, ce qui entraînera probablement une absence d'amélioration du rendement après 24 heures de fermentation. Le criblage de souches à haute résistance à la pression est donc bénéfique pour la fermentation, assurant ainsi que les souches industrielles sont suffisamment robustes pour maintenir une activité métabolique élevée lorsque des rendements élevés en produits sont obtenus. Une autre voie pour surmonter cette inhibition métabolique est le développement d'un système de fermentation capable d'intégrer un processus d'extraction en aval pour éliminer les produits lorsque la fermentation s'accumule.